Sbírka astronomie se utvářela rovnoměrně od r. 1910, počínaje darem Františka Fialy, zakladatele geodetické skupiny muzea. V 50. a 60. letech byla převzata kolekce klementinské hvězdárny a několik dalších sbírek. Astronomické přístroje ve sbírce pochází z 16. – 20. st., jeden dokonce z 15. st. Jedná se o přístroje, které byly využívány v minulosti při astronomických měřením a dále demonstrační předměty k výuce a znázornění o uspořádání vesmíru. Celkový počet přístrojů je 407, z toho 174 dalekohledů a 139 slunečních hodin. Sbírka je rozčleněna na jednotlivé fondy: gnómonika, měření úhlů, modely vesmíru, dalekohledy, obrazy a různé. Mezi unikáty sbírky patří pozdně gotický astroláb z poloviny 15. st., přístroje Erasma Habermela z přelomu 16. a 17. st. NTM vlastní světově proslulou vývojovou řadu astrometrických přístrojů, na jejímž počátku jsou dva tzv. tychonské sextanty z doby působení Tychona Brahe a Johannese Keplera na rudolfinském dvoře v Praze. První z nich je od Josta Bürgiho, kolem r. 1600, druhý vyrobil E. Habermel v Praze r. 1600. Řada pokračuje dvěma kvadranty z 18. st., celokruhovými přístroji (altazimut, pasážník) z 19. st. a je zakončena Zeissovým dalekohledem z počátku tohoto století. Kromě vynikající kolekce slunečních hodin 16. – 19. st. má muzeum i kabinetní orloj od P. Engelberta Seigeho z konce 18. st.