Hlavním účelem železniční sbírky při založení muzea, podobně jako u většiny ostatních oborů, bylo především dokumentování a propagování současné železniční techniky. Přední české železniční strojírny, jejichž zástupci byli členy příslušné "oborové skupiny", darovaly do sbírek muzea mnoho vzorků nových nebo zkoušených součástí. Postupem času se činnost železničního oddělení zaměřila především na dokumentaci vývoje železniční dopravy na území dnešní České republiky.

Vedle rozsáhlé sbírky historických kolejových vozidel, která čítá více než 150 vozidel normálního nebo úzkého rozchodu a neustále se doplňuje, sbírá Železniční muzeum NTM rovněž součásti hnacích i tažených vozidel (pojezd, kotel, parní stroj, vozová skříň), různá železniční zařízení (přístroje, zabezpečovací technika, uniformy) a příslušné doplňky. V omezené míře jsou ve sbírce zastoupeny artefakty z oboru městské hromadné dopravy, na kterou se však u nás zaměřila jiná, specializovaná muzea.

Železniční sbírka je pro větší přehlednost dále rozdělena do tzv. podskupin, které obsahují sbírkové předměty k daným okruhům železniční historie.

Dílny

Kromě unikátního parního bucharu Davis&Primrose z roku 1872 a několika mechanických zařízení je tu především soubor strojního vybavení bývalé hospodářské strojírny, které bude sloužit v nové části budoucí expozice ŽM – tzv. železniční strojírně.

Drezíny

Ve sbírce jsou jak drezíny na ruční a/nebo nožní pohon (nejstarší z roku 1850), tak motorové drezíny – otevřená drezína firmy Ringhoffer z roku 1908 nebo nejstarší výrobek příbramské strojírny Wohanka z roku 1910. Kromě nich jsou zde také čtyři autodrezíny Tatra – nejstarší z roku 1930 je čtyřmístná s karosérií typu „nástavková limuzína“, nejmladší a také nejluxusnější z 1952 je šestimístná – hrála např. v oskarovém filmu „Ostře sledované vlaky“.

Komunikace

Podskupina zachycuje vývoj komunikačních prostředků, např. telegraf a telefon, které sloužily k dorozumívání při železničním provozu u jednotlivých železničních společností na území dnešní České republiky od roku 1850 po dnešek.

Lokomotivy

Lokomotivy

Téměř 80 vozidel pokrývá parní lokomotivy i hnací vozidla moderních trakcí, nejvíc bývalých ČSD, a to od poloviny 19. století do konce 60. let 20. století. Nejcennější je polotendrová parní lokomotiva někdejší Buštěhradské dráhy I.103 „Kladno“ z roku 1855 – je to nejstarší parní lokomotiva dochovaná na našem území a současně nejstarší ze tří dochovaných strojů tohoto typu na světě. Unikátem je ozubnicová parní lokomotiva 404.003 z roku 1901, původně G 23 „Polaun“, která byla dodána pro naši jedinou „zubačku“ Tanvald – Kořenov. Za pozornost stojí rovněž parní vůz M124.001 „Komarek“, který byl v letech 2015 - 2016 opraven do provozního stavu, nebo historický elektrický motorový vůz M400.001 z roku 1903, který dosud jezdí na své kmenové trati – Křižíkově první meziměstské dráze Tábor – Bechyně. Několik vozidel je vystaveno ve stálé expozici historie dopravy ve dvoraně NTM na Letné, největší část sbírky je k vidění ve zpřístupněném depozitáři v Chomutově. Další vozidla jsou k vidění též kupříkladu v expozici Muzea ČD v Lužné u Rakovníka, některé se jako provozuschopné exponáty zúčastňují pravidelných historických jízd.

Modely

Vedle historicky cenných, původně provozuschopných modelů, z nichž největší hodnotu má tzv. lokomotiva bratří Maříků z let 1866-1874, se ve sbírce nacházejí i modely lokomotiv a vozů motorové nebo elektrické trakce, např. rychlíkovou lokomotivu Breitfeld&Daněk z období elektrizace pražského železničního uzlu v roce 1927.

Nádraží

Podskupina má za úkol dokumentovat vybavení exteriérů a interiérů nádražních budov, např. nádražní vyvolávací zvonek, informační zvon, nebo pokladny, v tomto případě Hlavního nádraží v Praze. Časový rozsah podskupiny je od poloviny 19. století do dnešních dnů.

Osoby 

Podskupina obsahuje sbírkové předměty pojící se s osobami pracujícími v železniční dopravě, nebo s osobami budujícími železniční síť na našem území. Jsou v ní obsaženy např. uniformy zaměstnanců drah, jejich součásti a busty, mj. Františka Křižíka.

Přístroje

Měřicí a kontrolní přístroje tvoří součást příslušenství hnacích nebo tažených vozidel, resp. různého drážního zařízení, včetně tzv. indikátorů parních strojů. Jsou mezi nimi především tlakoměry, teploměry a rychloměry, některé provedené jako registrační pro trvalé zaznamenávání naměřených hodnot k provozním nebo zkušebním účelům.

Součásti

Podskupina obsahuje nejrůznější díly nebo menší konstrukční celky vozidel a ostatních zařízení, např. kola, kotle nebo jejich části – armatury, lokomotivní parní stroje, součásti pohonu a rozvodu a mnohé další.

Tramvaje

Okrajová sbírka obsahuje kromě unikátního podvozku motorového vozu Křižíkovy elektrické dráhy Praha – Libeň – Vysočany z roku 1896 a řady kontrolérů také skříň motorového vozu pražské tramvaje č. 265, kterou navrhl architekt Jan Kotěra a vyrobily Ringhofferovy závody na Smíchově.

Tratě

Podskupina obsahuje sbírkové předměty dokumentující vývoj železničního svršku. Jsou zde např. vzorky kolejnic z jednotlivých období výstavby železnic u nás, včetně těch nejstarších koňských. Časový rozsah je od dvacátých let 19. století po současnost.

Vozy

Tzv. tažená vozidla (bez vlastního pohonu) jsou zastoupena všemi druhy od nejluxusnějších salonních vozů přes osobní, služební a poštovní, přípojné vozy z motorové dopravy až po vozidla nákladní – zavřená, otevřená i zvláštního určení. Salonních vozů má NTM ve sbírce pět – většinou je vyrobila Ringhofferova vozovka na Smíchově, největší strojírna toho druhu v bývalé monarchii. Původní jídelna dvorního vlaku císaře Františka Josefa I. s bohatou výzdobou (1891) je vystavena na Letné, vůz pro cesty následníka trůnu Františka Ferdinanda d´Este (1909) je příležitostně provozován, dvounápravový vůz pro někdejší Ústecko-teplickou dráhu (1900) a čtyřnápravový vůz vyrobený pro barona Rothschilda v Kopřivnici (1906) jsou uloženy a prezentovány v Chomutově. Nejnovějším přírůstkem je salonní vůz pro prezidenta republiky z roku 1968 vyrobený vagonkou ve východoněmeckém Budyšíně. I ten je příležitostně provozován.

Zabezpečení

Podskupina obsahuje sbírkové předměty prezentující vývoj železničního zabezpečovacího zařízení na území dnešní České republiky. Podskupina zahrnuje časový rozsah od třicátých let 19. století po současnost. Jsou zde např. mechanická návěstidla různých železničních správ, nebo elektromechanické řídicí přístroje. Podskupina je stejně jako ostatní průběžně doplňována dalšími sbírkovými předměty.